一般就商业化试剂盒而言，在上市前应完成一定的耐用性研究，比如在不同检验设备上的适用性，不同实验室间，不同精度条件下的性能表现研究。在特定实验室展开的工作可以不做额外耐用性研究。但是如果涉及室间平行性验证以及残留检测报告，就需要进行耐用性研究。

因为PCR技术的高灵敏度，主要污染可能来自操作环境中的气溶胶，或者校准品配制产生的气溶胶。因此建议定量PCR检测实验室参考PCR标准实验室进行设计和执行规范操作，使用带滤芯的移液枪头，规范移液操作，以及实验阳性垃圾处理规范等。在不具备标准PCR实验室条件下，尽可能采取阴阳性分区操作模式，先阴后阳的一般规则，避免阳性物质污染到样本。此外，每次的检验，应完整设计对照，用于污染水平控制，包括NTC，NEG/NCS。

阴性对照的Ct值来自NTC以及NEG/NCS,分别代表扩增试剂本身的背景，以及含有样本后产生的反应背景。不同检测系统会产生不同的Ct值，而且不同设备或不同实验室的阴性对照Ct值也会有差异，其合格的决定因素在于背景是否与LLOD或者LLOQ能显著区分开。 关于IC，做为内部质控对照，起到了监测特定反应是否存在干扰的作用。原理上因为干扰物对不同扩增反应影响程度不同，常见干扰物对于IC对照干扰作用更显著，因此会出现干扰物的存在对样本检测通道的Ct影响看起来不大，但是对IC通道Ct值产生明显影响，有利判断样本检测结果是因为大误差还是干扰；

不确定度的计算，除了需要根据移液器的精密度来计算，还需要确定传递方式。因此考查不确定度时，需要以移液设备以及制备工艺为基础；

方法学验证一般需要进行2-3批的验证，重复性和准确度的评价是方法学验证中必须验证的项目，也需要完成2-3批的验证。定性方法学与定量方法学在具体验证中要求有所不同，可以参考药典及行业标准的要求。

药典规定回收率是50%-150%，一般行业标准是70%-130%。

关于定量下限检测Ct值的问题，因为我们是用的非16s单拷贝基因，所以本身在30fg/ul，也就是差不多60个拷贝，Ct值有可能是超出35的。另外最后一点的检测重复性不好也是因为拷贝数低，在溶液体系中存在泊松分布，有可能在造成稀释的不准确或者是加样吸取的误差。

均适用，但要考虑样本的干扰问题，进行适用性研究。

SPA回收率低，和抗体以及基质pH，盐离子，或表面活性剂/变性剂有关。

不需要，我们采用的是热变性前处理方法。