影响扩增效率的因素很多，任何一个影响反应的因素，比如：酶，缓冲液等都会影响扩增效率，但是对于商品化试剂，试剂的组分影响已经经过了充分考核验证。因此，在合理保存的产品效期内，更换操作人员出现的扩增效率变化，更多源于每次校准曲线各浓度点配制误差。此外仪器设备未经过定期校验，可能会出现个别扩增孔位不稳定，或者因为实验室电压不稳定，造成检测波动。

质粒DNA样本会以两种方式造成干扰。1. 质粒DNA含有同源引物、探针序列；2.高浓度质粒模板造成非特异性扩增。CHO宿主细胞一般不用于质粒生产，不会遇到质粒DNA的干扰。但是如果设计用CHO细胞生产病毒药物或病毒疫苗，则会因为病毒样本的病毒核酸，或者错误封装进入病毒粒子的宿主核酸，造成干扰。

根据USP的接受标准，根据不同稀释点测定结果与理论值所产生的拟合直线应满足斜率1±0.2 (即偏差≤20%)，R2≥0.95，截距与零无显著差异；实际评价需要结合加标回收率进行，以最高浓度点为参考点，回算各个稀释点浓度做为理论浓度；当样本稀释后，报告值已经低于LLOQ，那么不在继续向下评价稀释线性。稀释倍数的选择，应根据方法学的系统误差水平来合理设计，避免稀释倍数过小。

在试剂合理保存以及效期内的情况下，校准曲线不稳定，和曲线校准品配制、仪器稳定性（电压、Cq读取方法）关系较大。尤其是校准品低浓度点，是多次逐级稀释下来，本身误差在逐级放大，容易出现波动。降低波动，提高稳定性的办法，主要是建立稳定校准品稀释操作SOP，配备专用移液器。10倍方式稀释方法的误差，可以通过移液器校准检验来获得，通过各个操作步骤产生的误差，逐级推算各个校准点的不确定度；因此，降低误差的办法尽量采用较大体积的配制方案，提高配制准确度，

加标设计是在样本适用性研究中必须要进行的项目，但是在日常检验中，不是必须的。如果在方法学验证合格，并且实验室建立检验SOP后，加标不一定需要成为日常检验的项目；

合理设计加标的范围，目前没有公开论文报道，实际检验需要跟据检测方法学本身的准确度偏差进行合理设计，避免加标水平设计过于接近误差范围。就核酸残留定量PCR的方法学特点，一般来说，将加标水平设计范围放在50-150%具备较好的可操作性；

加标回收率不稳定，和很多因素有关，包括前处理操作等。因此建立经过验证的稳定SOP至关重要。此外为了稳定加标结果，从实验设计上，加标量需合理设计。在缺乏标准物质或参考物质情况下，比如利用高浓度校准品进行稀释操作制备出来的加标物，尽量避免利用理论值来推算加标水平，建议对加标物进行实际检测定量做为实际加标水平来计算回收率；

当样本残留水平低于LLOQ，残留报告值的准确度偏差超过了LLOQ的合理范围，根据药典要求，残留报告应为限度报告，而不是残留值。因此不建议进行单一加标水平验证，至少在LLOQ水平及以上设计3-4个加标，结合各个加标水平综合评价，而不是单一通过LLOQ加标水平进行评价，因为该点的回收率有一定几率不合格；

不建议过量加标，因为检测准确度误差，10倍或以上的加标设计，可能导致反应竞争性原因与未加标的样本反应Km存在显著差距，回收率始终合格，却无法真实反映样本干扰情况；此外因为方法学的原因，加标量不能超过定量上限；

如果不同样本基线不一致，除了设备原因，可能是样本的均一性不够好，可以考虑优化前处理程序，提高前处理稳定性；对于基线设置，一般建议采用统一基线设置方式，如果各个反应差异较大，可以考虑为每个反应独立设计基线范围，参考扩增曲线拐点，以及信号稳定起始循环；阈值线设置同样，优先建议建立稳定SOP。对于不稳定的案例，有可能是个别反应因为阈值线交叉点设计不在线性增长区域，与其他校准曲线也不相互平行，可以考虑调整阈值线，到扩增线性增长区域，并且校准扩增曲线间处于相互平行区域，当然采用二阶求导模式也是可以尝试。