普通PCR检测方法：样本不经过前处理；PCR扩增后通过电泳观察目的片段的扩增情况判断阴阳性；检测灵敏性低； 本试剂盒：经过前处理提取样本微量支原体核酸；采用荧光探针qPCR技术，通过扩增曲线CT值判断阴阳性；检测灵敏性高；并设置多种控，有效避免假阴性结果；

1. G/C指基因组拷贝数(genomic copies GC)与活菌数(colony forming units CFU)的比值。基于NAT的方法可检测样本中支原体核酸的拷贝数（GC)，不考虑细菌细胞的活率；而基于药典培养法只能检测活菌数（CFU）。NAT-based方法的 limit of detection (LOD)通常表达为最低数量的基因组拷贝(GC)，而药典培养法的LOD则为最低活菌数(CFU)； 2. 支原体样本中GC/CFU可能有很大差异，较低的GC/CFU反应了支原体较高的活率和较低的聚集程度。因此，在使用NAT方法与药典方法进行可比性研究时，应使用低GC⁄CFU的支原体标准株。开发和制备一组低CG⁄CFU比的活支原体参考株，对于评价和验证基于NAT的支原体检测方法具有重要意义。

中国药典ChP：支原体检查仅包含培养法和指示细胞法，未明确NAT方法可以替代传统方法，也未对NAT方法作出规范； 欧洲EP2.6.7及美国药典USP<77>：明确NAT方法在经过一定验证后可替代传统检查方法（培养法、指示细胞法），目前新的指导原则中，对于NAT方法验证中的标准株有新的规定，G/C比低于10；

EP 2.6.7建议使用与支原体亲缘关系较近的菌株，包括梭菌、乳酸杆菌和链球菌等革兰氏阳性菌；

原则上抽样设计与方法学检测灵敏度以及风险控制设计相关。由于需要考虑低污染水平条件下的检出，因此难以用正态分布方式来估计检出概率，泊松分布比较适合用于该情况下的污染及检出概率估计。抽样设计上需要结合批生产量，取样体积，抽样数量，和方法学检测限来综合估计检出概率，基于风险水平，设计抽样放行办法。

假阳性发生原因：1. 样本中存在支原体核酸或者死菌；qPCR方法可以检测到支原体核酸或者死菌，而药典培养法只能检测到活菌导致检出差异；2.前处理过程污染导致假阳性。 例如血清产品，经过了药典培养法验证为阴性，但荧光定量qPCR法测试有时会报告呈阳性，这是因为血清产品的生产工艺能有效去除微生物颗粒，包括支原体这类最小的微生物，但是对于微生物细胞破碎后的核酸残留碎片不能有效去除，因此有可能出现上述假阳性现象； 建议：1. 对于可能在样本基质中含有微生物核酸残留的样本，建议用高速离心去基质的方法检查，以规避假阳性报告。一般情况下，16000g，20min离心条件对目前已知的支原体种类可以回收99%以上的支原体，而核酸会保留在离心后的上清中；2. 对于前处理存在污染的情况，可以通过NCS样本监控前处理过程，排除假阳性结果。

1.磁珠充分混匀，使用过程注意观察磁珠状态，聚团或者是弥散均需要对样本的基质进行分析研究；聚团情况需要完全震散，尤其是洗脱步骤；弥散状态需要对样本进行稀释或者是采用16000g离心的方式完全去基质保留支原体； 2.RC的使用，必须与PC为同一批次，保证结果的一致性

1. 支原体检测样本一般是培养上清、细胞、冻液、TEbuffer等，前处理配方在该基质上面更有利，无酶水作为基质，磁珠的吸附的信号慢一些，后续试验可以适当延长磁吸时间 2.支原体试剂盒磁珠粒径较小， 磁吸时间需要稍微延长，一般需要3min左右，进一步保证回收率 3. .Wash buffer中乙醇浓度的确认，盐浓度较高会导致磁吸失败 4. 洗脱样本中乙醇的残留情况，乙醇会产生扩增抑制

由于相对扩增后的产物浓度极高，更容易造成污染和假阳性，因此通过UNG/UDG酶催化水解扩增后已经掺入尿苷酸的DNA产物，使得扩增产物无法进一步扩增，而达到防止气溶胶污染的目的。

蛋白、离子，特别是二价离子，螯合剂、乙醇、甘油、异丙醇、pH等；