cfDNA在样品中的含量本身有一定的差异；对于样品本身，要注意其来源和储存条件，血浆、血清分离的时间避免过长，冻存后注意避免温度波动及反复冻融；在试剂盒使用过程中，建议操作人员尽量避免更换以减少操作误差导致的得率波动

血清、血浆均可；样品起始量根据不同产品在0.2-10mL之间；建议起始样品量不少于2mL

ELISA的测定结果可分为两种：定性测定和定量测定。前者只需确定阴性或阳性即可；后者则需要给具体的数值。在定量测定中，经常要将标准品所获得的吸光值进行标准曲线的绘制

读板时要保证酶标板清洁，同时也要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。 通常，单波长读板的测定值一般是指以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长读板的测定值一般是敏感波长如450nm的吸光值与非敏感波长下如630nm的吸光值之差，可排除板内脏物的影响。同时，由于ELISA测定中单个空白孔的非特异吸收上有一定程度的不确定性，也就是说每次测定或同次测定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度测定值，故而在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色

目前以HRP作为标记酶的商品ELISA试剂盒中，如以TMB为底物，则提供的底物为A和B两瓶应用液；如以OPD为底物，则试剂盒提供OPD片剂或粉剂，临用前配制。显色剂配制后放置时间过长（肉眼可见浅蓝色的TMB时）要弃之不用。在加入底物开始显色反应前，最好是先检查一下底物溶液的有效性，即可将A和B两种液各加一滴于清洁的空板孔或eppendorf管中，观察是否有显色出现，如有，则说明底物已变质。 显色反应条件一般为37℃或室温反应15-30分钟。加终止液时，要避免气泡产生而引起的假阳性

为了确保ELISA测定的特异性，洗板可清除非特异性结合物质，减少背景信号，增加分析的信噪比。 手工洗板时，拍板要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离。使用半自动洗板时，应经常检查冲洗头是否通畅，若被杂物堵塞时可用注射器针头挑出。为了达到较好的洗涤效果，实验室可采用机器与人工洗涤相结合的方法，即在机器洗涤后再进行人工洗板1-2次。 以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中使用的洗板液一般为含0.05% Tween20的中性PBS，其中，吐温20的浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低实验的灵敏度

一般孵育时间与温度成反比，即温度越高，所需时间相对较短。最常用的孵育温度为37℃，孵育1-2h。 孵育时应贴封片或加盖，避免样品或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗。孵育时，反应板不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。同时，应严格控制孵育时间，避免因时间过长导致紧附于反应孔周围的非特异性结合。 孵育时，要尽量排除“边缘效应”，即96孔板的外周孔显色较中心孔深。究其原因，是因为96孔板周孔与中心孔的表面或热力学特征不同。因此，可采用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至孵育温度（37℃）

因ELISA的灵敏度较高，则应该按规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。 加样品时，单孔用量要求：≥20ul/指标，如需要做2个复孔则血量≥60ul/指标。如果用量充足，最好提供50ul/孔/指标。具体用量也需根据试剂盒的要求而定。 吸取样品时，加样枪头不应粘附多余的液体；加样时不可90度向孔中滴加液体，否则会导致液体残留在吸头上，加样不准确。正确加样方法应为45度，吸头贴着孔壁和液面的交界处加入。加样时速度不可过快，否则无法保证微量加样的准确性和均一性；要避免样品加在孔壁上部而产生非特异性吸附。不可将样品溅出以避免对邻近孔产生污染