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ELISA试剂盒操作注意事项:加样

因ELISA的灵敏度较高,则应该按规定将血清稀释至适当的倍数,以降低非特异性反应,使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。 加样品时,单孔用量要求:≥20ul/指标,如需要做2个复孔则血量≥60ul/指标。如果用量充足,最好提供50ul/孔/指标。具体用量也需根据试剂盒的要求而定。 吸取样品时,加样枪头不应粘附多余的液体;加样时不可90度向孔中滴加液体,否则会导致液体残留在吸头上,加样不准确。正确加样方法应为45度,吸头贴着孔壁和液面的交界处加入。加样时速度不可过快,否则无法保证微量加样的准确性和均一性;要避免样品加在孔壁上部而产生非特异性吸附。不可将样品溅出以避免对邻近孔产生污染

ELISA试剂盒操作注意事项:试剂准备

在实验开始前,需将试剂盒从冰箱中拿出来在室温放置20min,再进行测定,以使试剂盒在使用前与室温平衡,也可使温育时反应孔内的温度能较快的达到所要求的高度,以满足测定要求。 其次,目前商品中ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验过程中对其所提供的浓缩液进行稀释配制,因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应该保证质量。此外,底物反应液应该反应显色前进行现配现用。同时,为了保证实验的均一性,实验中所有试剂在加样前必须摇匀。

ELISA试剂盒操作注意事项:样品的制备与保存

用于ELISA测定最常用的临床标本是血清(浆)。要注意避免严重溶血,因为血红蛋白中含有具有类似过氧化物活性的血红素基团,在孵育时很容易吸附于固相,与HRP底物反应产生假阳性。 样品采集及血清分离中要注意避免细菌污染,一方面细菌分泌的酶可能对抗原抗体等蛋白产生分解作用,另一方面,细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶会对相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 样品应该要避免反复冻融。因反复冻融所产生的机械剪切力对标本中的蛋白等分子产生破坏作用,从而引起假阴性结果。另外,样品混匀时,不要剧烈振荡,反复颠倒混匀即可。 一般而言,如果在收集样品的当天进行检测,可将样品及时储存在4℃备用;而对隔天再检测的样本,应及时分装后冻存在-20℃备用,若要长期保存样品,最好将其置于-70℃冻存。

误差的含义?如何尽量减小误差?

误差分为三类,系统误差、随机误差和过失误差。这三类误差中,系统误差对样本值和空白值之间的差异无影响。ELISA样本值低于空白值在误差方面主要来源于随机误差和过失误差。 随机误差 Random Error 无法控制的变因,使测量值产生随机分布的误差,服从统计学上的正态分布。从统计学上来看,测量值有99%的置信限在±3SD之间,如果CV值是20%,随机误差的边界就是±60%,也就是说在CV值20%的状况下,样本值低于空白值60%之内,有可能是随机误差的影响,特别是空白值只有一个值时。 随机误差不可消除,只能通过多次测量获得的均值尽量逼近真值。降低随机误差的解决方案1是增加空白值的重复数量,一般认为空白值重复10次,测量均值接近真值。 方案2是提高实验技能,也能够有效降低随机误差的影响。如果CV值在5%,样本值趋近于零时,在统计上样本值将不会低于空白值15%。 过失误差 Gross Error 过失误差主要是由于测量者的疏忽,犯了不应有的错误造成的。过失误差是可以避免的。针对于ELISA样本值低于空白值的问题,过失误差产生的原因多数来源于空白孔HRP的重复加样或污染或洗涤不干净,造成空白值偏高,相对比来说,样本值低于空白值。解决方案就是重复实验,规范操作。 基质效应 Matrix Effect 分析中,基质指的是样本中被分析物之外的组分,基质常常对分析物的分析过程有显著的干扰,并影响分析结果的准确性,这些影响和干扰被称为基质效应。ELISA试剂盒在开发过程中,标准品不能采用人或动物血清、血浆作为标准曲线的稀释液,只能采用其模拟物。模拟物与被测样本在蛋白丰度、复杂性、pH等因素都会存在差异。当样本的基质与其模拟物相比,降低抗原抗体的结合,便产生了样本值低于空白值的现象。造成样本值无法计算出数值,或者数值为负。 目前最常用的去除基质效应的方法是,通过已知分析物浓度的标准样品,同时尽可能保持样本中的基质不变,建立一个校正曲线(Calibration Curve)。 当单个样本或少量样本值低于空白值时,可能是误差原因,这时应增加重复,提高操作技能。当大量样本都低于空白值时,应考虑基质效应的影响,建立校正曲线予以修正。

为何会有样品数值低于标曲空白数值的情况?

在ELISA实验中,样本值低于空白值是一个经常性的问题。当样本值较低接近试剂盒的灵敏度就容易发生样本值低于空白值的现象,特别是在血清和血浆样本的检测。究其原因,主要在于两个方面,一方面是误差,另一方面是基质效应。下文逐个分析不同影响因素的原理、和解决方案。

血清或血浆样品为什么必须和稀释液1:1稀释后再加样?如果用原液加样是否可行?

血清、血浆样品请务必按照说明书要求,与稀释液1:1稀释后再加样。这类样品蛋白质含量高且成分复杂,容易造成对监测孔上的抗原表位的遮盖,与稀释液1:1稀释后可有效避免这一问题。

为什么所有试剂和检测样本要平衡至室温后再进行加样操作?

温度是ELISA结合反应的重要影响因素。为了使所有样本在一致的温度下反应,实验前务必将所有试剂平衡至室温,包括检测样本。避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。

为什么酶标仪读数时部分试剂盒建议选用双波长?

首先,酶标仪使用前务必预热10-15min,使测读结果更稳定。其次,ELISA实验采用双波长测定吸光度,可以排除单波长检测时的测定干扰(标本的浓度,干扰色等)。一般采用最大波长作为参照波长,在参照波长下,检测物的吸光值最小,检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收;因此,双波长测定,可最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差,以保证实验数据的准确度。

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