正在从复苏密度，培养基种类，筛选压力，摇床转速，抗剪切添加物等方面协同客户排查原因

293瞬转中添加的葡萄糖为3g/L，所以推荐客户配制300g/kg的葡萄糖溶液，每次添加培养体积的1%即可； 关于高浓度的葡萄糖配制时，不要用热水，会有一定的碳化现象，配置时，使用磁力搅拌器，一点点加入，溶解后再继续添加，配置完，使用0.22um滤器过滤除菌。不要用高压灭菌，会碳化。配置全程注意烧杯以及水的内毒控制。

HE01中含有EDTA，如果客户的蛋白是His标签，镍柱纯化，就会冲柱，影响收率

补料可以隔天补料，每次5%，葡萄糖就根据体系内葡萄糖浓度，补齐到6g/L，这个A1补料糖浓度为65g/L，计算的时候需要减去

除去葡萄糖后，大约是80g/L；渗透压稀释5倍后为260 mOsm/kg

主要是双组分的pH区别以及氨基酸的溶解度情况引起，调整PH后会恢复正常

HE01培养基需要额外添加终浓度为 6mM 的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺易降解，可每次使用培养基时加入谷氨酰胺，或者分装部分培养基添加谷氨酰胺后一周内使用。 如客户不想要额外添加，有HE01 plus定制培养基可以测试。 HE02以及HE03不需要额外添加，已含类似物。

1)需要在培养过程中额外添加终浓度为6 mM的谷氨酰胺；加入谷氨酰胺（Gln）后需一周内使用； 2)不可反复放置于37℃预热。如需37℃预热，可于每次使用前分出所需体积，放于37℃预热，剩余体积及时放回2-8℃冰箱保存； 3)如果细胞原来在其他品牌培养基里培养，可直接用本培养基产品传代培养，传代 3 次（9-10 天）后细胞可适应本培养基产品，活率、细胞密度稳定，可进行后续实验。 4)如果原悬浮293细胞是用其他品牌培养基培养后冻存的，请用冻存时使用的细胞培养基来复苏细胞，传一代后换成本培养基产品，再传代 3 次、细胞状态稳定，可进行后续实验。使用本培养基产品培养后冻存的细胞，则可以使用本培养基产品复苏 5）在驯化过程中出现大量结团现象，可以通过低速离心的方式去除较大的细胞团；若细胞团持续出现，需要在传代中加入一定的抗结团试剂，成功驯化后再去除 6）若出现活率降低的现象，可使培养环境便温和，如降低转速

1）依科赛培养基不含抗结团剂； 2）使用合适的转速：125mL 摇瓶内，培养体系为 20-30mL，推荐转速为 95 rpm（50 mm 转径摇床）或 125 rpm（19mm 转径摇床） 3）20g转速，离心3min，去除结团细胞，取上清继续培养 4）注意转染前不能加抗结团剂，转染后24h可以添加 5）肉眼可见比较大的细胞团、或活率降到70%以下，需要试用抗结团剂。

1）新复苏的细胞至少需要传代 4 次、且活率达到 90%以上再进行转染，转染前细胞密度为 2-3×106cells/mL（根据实验的转染密度，提前一天接种细胞）。将质粒、转染试剂分别加入无菌 PBS（或转染专用稀释液）中稀释，室温静置 5 分钟。将转染试剂稀释液缓慢加入到质粒稀释液中，混匀，室温孵育 10-15分钟。将质粒-转染试剂混合物加入悬浮 293 细胞培养液中，放入培养箱中培养。转染后无需换液，48-72 小时后可进行转染效率检测、收获蛋白或病毒等操作。 2）本培养基产品支持 PEI、脂质体等转染试剂。如细胞密度为 2×106cells/mL，建议添加质粒量为 1µg/mL；如细胞密度为 3×106cells/mL，建议添加质粒量为 1.5µg/mL。如使用 PEI 转染试剂，PEI 与质粒的质量比例建议为 3:1。