【文献速递】MSC-EV表面携带的N-糖基化修饰发挥抗炎调控作用

研究团队首先对MSC-EV进行了分离和多维度表征，以确认分离与酶切处理后的EV的生物特征是否变化。该研究采用iWJ-MSC-EV（infrapatellar fat pad-derived Wharton's Jelly MSC, iWJ-MSC，髌下脂肪垫来源华通胶间充质干细胞), 发现PNGase-F 处理并未影响EV的分离回收率与最终产量。

通过对EV数量的表征（NTA、蛋白质、脂质定量以及流式细胞术），表明PNGase-F酶切没有影响MSC-EV的产量; 通过免疫印迹检测EV阳性标志蛋白，并以ER标志物排除细胞碎片污染；此外，使用冷冻电镜观察EV形态和膜完整性，NTA测定粒径分布，图像显示出了完整的、圆形的双层膜纳米囊泡，且粒径维持在50-250nm。这些结果提示，PNGase-F酶切并未影响本研究中MSC-EV的分离和特征，为后续功能与机制研究提供了可靠的样本质量保障。

那么MSC-EV表面的N-糖基化修饰是否影响内皮细胞的激活及对EV的摄取？研究团队使用了荧光显微镜，观察评估了TNF-α 激活刺激或未刺激条件下的HUVEC单层细胞对iWJ-MSC-EV的摄取情况。研究人员发现，在无TNF-α 激活刺激条件下，HUVEC细胞能够有效摄取CFSE-labelled iWJ-MSC-EV ，显微镜下可见细胞内呈现绿色荧光；然而，当EVs经PNGase-F酶切处理后，在无TNF-α激活刺激的静息内皮中，摄取几乎完全消失。相反，研究发现不论是否使用PNGase-F酶切除EV表面的N-糖基化修饰，被TNF-α激活激活后的HUVEC均能摄取EVs，并且显示出相当的细胞内绿色荧光强度，这表明炎症内皮（TNF-α激活) 通过N-糖基化非依赖途径摄取EV。

为了进一步评估在生理相关条件下的EV捕获，研究人员采用了流动模型来模拟体内环境。结果显示，在模拟的流动模型下，每个细胞可检测到的绿色荧光区域明显比静态实验条件下减少，反映了更严格的EV捕获环境。尽管如此，不论是否使用PNGase-F处理EVs，在TNF-α 激活活化的HUVEC单层细胞中仍然可检测到绿色荧光，表明在动态模拟环境下依然能够有效捕获EV。

这些结果表明，虽然在流动条件下的EV信号绝对值较低，但在静态条件下观察到的相对生物学趋势依然保持，说明无论N-糖基化状态如何，TNF-α 激活活化的内皮细胞能有效摄取EV。进一步的机制研究发现，PNGase-F处理后，尽管炎症内皮仍可摄取EV，但这些EV失去了抑制CCR2介导的单核细胞黏附的能力，提示N-糖基化不仅调控摄取，更可能通过摄取后的内皮重编程或EV货物递送影响炎症反应。在模拟生理剪切流的条件下，去糖基化EV无法抑制单核细胞在炎症内皮上的滚动与黏附级联反应。

MSC-EVs是再生医学与免疫治疗中极具潜力的“无细胞”策略，其安全性在早期研究中总体良好。这项研究不仅在多种体外模型中揭示了N-糖基化在MSC-EV免疫调节活性中的作用和分子机制，也为通过工程化改造MSC-EV的N-糖基化提升EV对炎症内皮的靶向性提供了新的思路。

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是一类几乎所有活细胞都会释放的囊泡物质，内含多种生物活性分子，包括核酸、蛋白质、脂质和代谢物。外泌体（exosome）是细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）中的一个亚类，直径约30–150 nm，经内体—多囊泡体(MVB)途径生成并分泌，表面常富集CD9、CD63、CD81等四跨膜蛋白，以及TSG101、Alix等内体标志物。

近年来，MSC来源细胞外囊泡（下称MSC-EVs或MSC-sEVs）逐渐成为主流学术表述, 但尚存在二个概念混用的情况。因此在阅读文献或相关内容时，我们一方面需要注意区分作者使用的是exosome还是EVs，另一方面也需要并关注其囊泡粒径、生物标志物表征, 及分离方法等。以下是细胞外囊泡的异质性图示2：

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